Инфекционный перитонит кошек диссертация

Клинико-эпизоотологические особенности и диагностика инфекционного перитонита кошек : диссертация . кандидата ветеринарных наук : 16.00.03

Номер работы: 300158

Автор: Рахманина, Надежда Алексеевна

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Просмотр 1 страницы = 3 руб

Оглавление диссертации:

. В последние годы в России возрос интерес к разведению высокопородных кошек. Как и следовало ожидать, возникла необходимость в получении новых сведений о заболеваниях этих животных. Среди вирусных инфекций представителей семейства Felidae инфекционный перитонит занимает особое место. Болезнь вызывается коронавирусом, относится к категории «медленных» и имеет степень летальности, близкую к 100%. Зарегистрирована во всех странах мира. Существует множество споров относительно механизма передачи

. Целью настояш;их исследований явилось изучение особенностей клинического проявления инфекционного перитонита кошек, выделение изолятов вируса инфекционного перитонита кошек, изучение некоторых их биологических свойств, освоение методов диагностики болезни, проведение анализа полученных эпизоотических данных. Цель работы определяла основные задачи исследований. 1. Выделить изоляты вируса инфекционного перитонита кошек, изучить их биологические свойства. диагностических сывороток. 2. Изучить

1.3. Научиая новизна. Впервые в отечественной ветеринарной практике изучены клинические и эпизоотологические аспекты инфекционного перитонита кошек, выделены изоляты вируса ИПК. Впервые в РФ паспортизирован и депонирован во Всероссийской Государственной коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» штамм вируса для инфекционного перитонита кошек, Депонировать штамм вируса для получения предназначенный получения диагностических патентом сывороток. от Приоритетность разработки подтвержден

. Практическая лабораторную кошек РПГА ценность работы определяется

введением в практику методов диагностики инфекционного перитонита и МФА. Практикуюшим ветврачам рекомендовано использование теста йодной агглютинации и пробы Ривалта для диагностики ИПК уже при клиническом обследовании подозрительных по заболеванию животных. Полученные результаты легли в основу нормативной документации на «Набор для выявления антител к коронавирусу плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации (РПГА)»

. Основные положения диссертационной одобрены на заседаниях Ученого совета, работы обсуждались и в установленном методических комиссиях, конференциях молодых ученых ФГУ «ВГПКП» (2002-2006гг.). Сделаны сообщения на конгрессах и конференциях: II Междунар. межвуз. НПК аспир. и соиск. «Предпосылка и эксперимент в науке» (СПетербург, 2004); XII Междунар. Московском конгр. по бол. мелк. дом. жив. (Москва, 2004); Конф. молод, уч., поев. 75-летию ФГУ «ВГЬЖИ» «Лекарственные средства для животных

1.6. Основные ноложення днесертационной работы, выноснмые на защиту.

— Результаты изучения биологических свойств вируса инфекционного перитонита кошек: его патогенные, антигенные и культуральные свойства.

— Применение методов РНГА, МФА, ИАТ и пробы Ривалта для диагностики инфекционного перитонита кошек.

— Результаты изучения клинических и эпизоотологических особенностей инфекционного перитонита кошек.

1.7. Публикации научных исследоваиий. Основные результаты диссертации опубликованы в 10 научных работах, в том числе изложены в заключительном отчете ФГУ «ВГНКИ» за 2000-2005 г. (.№ Гос. Регистрации

01.200.112122). Патентом на изобретение № 2250260 от 26 сент. 2003 г определен приоритет на «Штамм Feline coronavirus», используемый для контроля иммуногенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики инфекционного перитонита кошек».

1.8.Структура и объем диссерт

1.1.СВЕДЕНИЯ О ВОЗБУДИТЕЛЕ БОЛЕЗИИ

1.1.1. Историческая справка. Этиология болезии. Инфекционный перитонит кошек (FIP, ИПК) — болезнь, вызываемая коронавирусом регистрируется в семействе Felidae [150, 233, 234], и широко распространена во всем мире [ПО, 181]. Инфекция относится к категории «медленных» и почти всегда имеет летальный исход [79,110,181]. Инфекционный перитонит — относительно новая болезнь кошек. Причина внезапного появления FIP не известна. Интересно то, что известия об инфекционном перитоните кошек появились в

1.1.2. Таксономическое положение вируса ИПК Согласно классификации, представленной в 7 докладе Международного комитета по таксономии вирусов (МКТВ) коронавирус кошек относится: к порядку Nidovirales, семейству Coronaviridae, роду Coronavirus, первой антигенной группе, и представлен видом Felinae Coronavirus [И]. Из таблицы 1 видно, что в настоящее время семейство Coronaviridae представлено 2-я родами: род Coronavirus и род Torovirus. Род Coronavirus насчитывает 3 антигенные группы. Представи

1.1.3. Антигенные разновидностн и родство вируса ИПК с другими нредставнтелями этого рода. Написание этого раздела продиктовано необходимостью внести ясность во взаимоотношения множества коронавирусов, которые могут, не вызывая патологии, инфицировать кошек и создать трудности диагностического плана. Из всех вирусов 1 антигенной группы (рис. 1), FIPV наиболее близко связан с вирусом трансмисивного гастроэнтерита (TGEV) свиньи [245], и коронавирусом собаки (ССV) [ 109,177]. В частности устан

1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЕЗИИ.

1.2.1.Эпизоотологические данные. Вирус инфекционного перитонита кошек (FIPV) вызывает болезнь чаш;е всего у домашних кошек, но также может встречаться у широкого круга различных видов диких кошачьих [34, ПО, 181]. Среди них FIP был диагностирован у льва [53, 54], нумы [74], леопарда [54, 223], генарда [183] и ягуара [54,75]. А так же у более мелких диких кошек, включая европейских лесных кошек [235], сервалов [152], рысь, каракала [184], песчаного кота [220] и манулов [181]. Kennedy и др. (20

1.Патогенез. Хотя механизмы возникновения ИПК еще до конца не понятны, в иностранной литературе прослеживается две концепции, на которых базируются дальнейшие предположения. Первая концепция была предложена в 1981 г, Pedersen: FIPV является результатом мутации FECV в желудочнокишечном тракте [168], Автор считает, что кошки-переносчики коронавирусного энтерита могут служить дополнительными источниками FIPV[175,181]. Вторая концепция описывает механизм иммунитета, формируемого в слизистой обо

Результаты исследований ряда авторов показывают, что экспериментальное воспроизведение FIP далеко не всегда бывает успешным. Анализ научной литературы, проведенный Barbara W. с соавторами (1976) показали, что клинически выраженную болезнь удавалось вызвать (по данным разных исследователей) только у 66-80% кощек. Тем не менее. Ward И Pederson (1969), используя в опыте 15 котят 1,5-6 месячного возраста показали, что произведенное ими заражение вызвало клиническое развитие болезни у всех животн

. Вирионы коронавирусов (рис.

3) являются наибольшими из всех РНК содержащих вирусов, и представляют собой сферические или плеоморфные частицы диаметром 60-200 нм. Вирусные частицы состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, с булавовидными выступами (пепломерами) [181, 236] длинной 12-24нм, образующими подобие солнечной короны, видимо эта аналогия и дала начало названию — Coronavirus [107, 165,182]. Геном представлен одноцепочной линейной, положительной цеп

Многие ученые сообщают о трудностях культивирования полевых штаммов коронавируса кошек [20, 249]. Впервые вирус инфекционного перитонита кошек был получен in vitro в перитониальных макрофагах Pedersen (1967), и позже Horzinek и Osterhaus (1978) в клеточной культуре мозга подсосных мышей, крыс и хомяка [111, 156, 179]. В дальнейшем, ряду авторов удалось осуществить культивирование вируса и на других клеточных линиях [44, 64, 151, 168, 181, 107, 203, 249]. Woods R.D. (1982) показал, что для изу

. Устойчивость FIPV в окружающей среде низкая. Он, как правило, инактивируются в течение суток независимо от влажности [20, 179]. Однако, по данным Scott (1991) после высыхания на поверхности, вирус может сохраниться в инфекционном состоянии в течение 7 недель [200]. FIPV легко инактивируется эфиром, концентрированным хлоргексидином, хлороформом 0,2 % формальдегидом и термической обработкой при 56°С в течение 1 часа. Относительно устойчив к 0,5% фенолу, низкому уровню рН и низкой температуре

1.4. ДИАГН0СТИ1СА ИНФЕКЦИОННОГО НЕРИТОНИТА КОШЕК

1.4.1.Клинические признаки болезни. Существует две основные формы клинического проявления инфекционного перитонита кошек. включает приблизительно 75% Классическую форму FIP, которая случаев, называют «влажной», воспалением «экспансивной» или «выпотной». Она характеризуется висцеральной серозной оболочки и, вследствие серозного эксудата. Вторая форма болезни, этого, образованием может проявляться гранулематозным воспалением брыжеечных лимфатических узлов, стенок кищечника, поджелудочной

. Типичное поражение при экспансивном FIP — пиогранулематозный васкулит [31, 106, 182, 222, 243, 247]. Пиогранулема состоит из некротических известковых отложений, нейтрофилов, окруженных плотным скоплением фагоцитарных клеток с включениями нескольких лимфоцитов и плазматических клеток. В пределах и вокруг поражений также депонированы значительные количества фибрина и богатая белком жидкость [243]. Пиогранулемы появляются отдельно или образуя серозные бляшки 0,5-2мм или больше в диаметре.

1.4.3. Биохимические методы диагиостики ИПК. Гематологические изменения сходны независимо от формы болезни. Как правило, имеет место лейкоцитоз с нейтрофелией, но без лимфопении. Примерно в половине всех случаев присутствует нерегенеративная анемия [1, 20, 88]. В некоторых случаях FIP были найдены тельца включения у циркулирующих нейтрофилов [110, 233]. У 50% кошек с экспансивным ИПК и 75 % кошек с неэкспансивным имеет место гиперпротеинемия (более 80 г/л) с повышенной долей глобулинов. Повыш

. Описано много серологических методов, использованных для диагностики FIP. К сожалению, серологические реакции не всегда позволяют дифференцировать возбудителей коронавирусного энтерита от возбудителей ИПК, а также выявить вирусоносительство [1, 20,165, 178], Многие ученые отмечают, что FEC и FIP инфекции серологически не различимы [46, 224]. Коронавирусный энтерит гораздо шире распространен и, в связи с этим, серодиагностика инфекционного перитонита чревата большей вероятностью погрешности

1.5. СРЕДСТВА ПРОФИЛАКТИКИ КОРОНАВИРУСИОЙ ИНФЕКЦИИ КОШЕК.

1.5.1. Специфическая профилактика ИИК. В настоящее время не существует надежной вакцины, защищающей от FIP. Очевидно, появление противокоронавирусных антител не защищает от болезни, и даже наоборот, может способствовать тяжелому течению в случае заражения кошки FIPV. Кроме того, Pedersen и Bleck (1983), считают, что гуморальный иммунитет может способствовать появлению у зараженных или вакцинированных аттенуированным штаммом животных скрытого или бессимптомного носительства [178]. Недостаточн

1.5.2 Профилактические мероприятия Смертность от FIP, по данным Pedersen, соизмерима со смертностью от других заболеваний кошек, включая вирус герпеса, калицивироз, хламидиоз, дерматофиты и паразитарные инфекции. Котята, содержащиеся в переполненном питомнике, часто перезаражают друг друга и зачастую Такие их болеют несколькими параллельно протекающими заболеваниями. условия снижают к иммунный статус животных, болезням, увеличивая и восприимчивость инфекционным способствует распростран

Материалы и методы. Работа проведена в период с 2001г. по 2007г. на базе лаборатории контроля и стандартизации лекарственных средств против болезней мелких домашних животных и пушных зверей, лаборатории молекулярных методов диагностики ФГУ «ВГНКИ», вивариях при ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» им Н.Ф.Гамалеи РАМН и ОНХ «Манихино». Материал для исследования получали из питомников и ветеринарных клиник г.г. Москвы и Санкт-Нетербурга, зоопарков г. Москвы и г.

2.1. Выделение и идентификация вируса инфекционного иеритоннта кошек. Для выделения изолятов вируса инфекционного перитонита кошек использовали асцитную жидкость от 14 спонтанно заболевших котят и 12 селезенок от этих животных, которые пали или были эвтаназированы. Все котята имели характерные для ИПК клинические признаки болезни, результаты патологоанатомического вскрытия соответствовали описаниям Perlman и др. (2005); Holmberg и Gribble (1973) и других авторов [106, 182]. Принадлежность из

Изучение патогенных и антигенных свойств вируса ИПК на лабораторных животных. Тканевые изоляты вируса с активностью 5,0 lg ИД50/см^ вводили кроликам, морским свинкам и белым мышам внутрибрющинно или подкожно в объемах 2,0; 1,0 и 0,5см^ соответственно. Пробы крови с соблюдением правил асептики и антисептики получали до заражения и еженедельно в течение месяца после введения вируса, кровь брали у кроликов из вен ушных раковин, морских свинок — при пункции сердца, у белых мыщей — при декапитац

2.5.1. Получение гипериммунных сывороток. Гипериммунизация кроликов выполнялась по двум схемам. При первой — тканевой очищенный микрофильтрацией вирус ИПК (5,0 lg ИД 50/см^) вводили животным еженедельно внутримышечно в течение 4 недель в объеме 1,0 см^, а затем, в той же дозе, однократно внутривенно. Во втором варианте использован метод «малых доз антигена», описанный Фримелем [19]. При этом вирус инъецировали в объеме 1,0 см» с таким же количеством неполного адъюванта Фрейнда, а через 2 мес

Источник

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему: Клинико-эпизоотологические особенности и диагностика инфекционного перитонита кошек

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Клинико-эпизоотологические особенности и диагностика инфекционного перитонита кошек

На правах рукописи

РАХМАНИНА Надежда Алексеевна

КЛИНИКО-ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННОГО ПЕРИТОНИТА КОШЕК

16.00.03- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Работа выполнена в лаборатории контроля и стандартизации лекарственных средств против вирусных болезней мелких домашних животных и пушных зверей Федерального Государственного учреждения «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ

Научный руководитель — доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Уласов Валентин Ильич

Доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Гунсшсов Виктор Всеволодович (ФГУ «ВГНКИ», г Москва)

Кандидат ветеринарных наук Литешсова Ирина Юрьевна (ФГУП «Щелковский биокомбинат»

ГНУ Всероссийский НИИ охотничьего хозяйства и звероводства им. проф. Б М. Житкова РАСХН (ВНИИОЗ, I .Киров)

Защита состоится «24» мая 2007г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.011.01 в Федеральном Государственном учреждении «Всероссийским государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».

Адрес: Россия, 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5, ФГУ «ВГ НКИ». С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ».

Московская обл , п Биокомбината)

Автореферат разослан «Л0» апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного с кандидат ветеринарных наук, доцент заслуженный ветеринарный врач РФ

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы В последние годы в России возрос интерес к разведению высокопородных кошек. Как и следовало ожидать, возникла необходимость в получении новых сведений о заболеваниях этих животных Среди вирусных инфекций представителей семейства РеМае инфекционный перитонит занимает особое место Болезнь вызывается коронавирусом, относится к категории «медленных» и имеет степень летальности, близкую к 100% Зарегистрирована во всех странах мира Существует множество споров относительно механизма передачи вируса от одного животного к другому, а так же патогенеза и причин спорадического возникновения этой болезни Гуморальный иммунитет при ИПК не является защитным, и даже наоборот — усугубляет тяжесть клинического состояния

До недавнего времени в нашей стране не существовало лабораторных методов выявления инфекционного перитонита кошек и диагноз ставили на основании характерных клинических и патологоанатомических признаков, описанных в иностранной литературе Выявление вирусоносительства и латентного течения инфекции в связи с этим было невозможным.

Наибольшую угрозу инфекционный периюнит представляет для питомников со скученным содержанием животных, распространенность инфекции повышается из года в год (Сулимов А А , 2004 I )

Учитывая частоту обращения практикующих ветеринарных специалистов по оказанию консультативной помощи по данной проблеме, в плановую тематику лаборатории контроля и стандартизации лекарственных средств против вирусных болезней мелких домашних животных и пушных зверей ФГУ «ВГНКИ» была включена работа по выполнению задания «Выделение, идентификация и изучение биологических свойств коронавируса кошек» № гос. задания 02 09 01 на 2001-2005г г. Работа предусматривала решение актуальных задач по выделению, депонированию отечественного штамма вируса ИПК, изучению некоторых его биологических свойств, освоению методов диагностики болезни

Цели и задачи исследования. Целью настоящих исследований явилось изучение особенностей клинического проявления инфекционного перитонита кошек, выделение изолятов вируса инфекционного перитонита кошек, изучение некоторых их биологических свойств, освоение методов диагностики болезни, проведение анализа полученных эпизоотических данных Цель работы определяла основные задачи исследований

1 Выделить изоляты вируса инфекционного перитонита кошек, изучить их биологические свойства Депонировать штамм вируса для получения диагностических сывороток.

2 Изучить изменение уровня антител у кошек на разных стадиях болезни и определить диагностический титр в РИГА

3 Изучить возможность использования МФА для обнаружения вируса инфекционного перитонита кошек в клиническом материале от больных кошек и секционном — от павших

4 Изучить возможность использования йодно-агглютинационного теста (ЙАТ) и тсста Ривалта как экспресс-методов диагностики ИПК

5 Изучить особенности клинического проявления и патанатомических изменений при ИПК Изучить заболеваемость инфекционным перитонитом кошек разных пород и возраста, проанализировать сезонность при этой инфекции.

Научная новизна. Впервые в отечественной ветеринарной практике изучены клинические и эпизоотологические аспекты инфекционного перитонита кошек, выделены изоляты вируса ИПК Впервые в РФ паспортизирован и депонирован во Всероссийской Государственной коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» штамм вируса инфекционного перитонита кошек, предназначенный для получения диагностических сывороток Приоритетность разработки подтверждена патентом № 2250260 от 26.9 2003 г, выданным Федеральным Центром промышленной собственности Роспатент

Дана биологическая характеристика штамму вируса ИПК «Багира» Получены данные о его морфологии, культуральных, патогенных и антигенных свойствах

Определен оптимальный способ конъюгации эритроцитов вирусом ИПК Оптимизированы условия постановки и учета результатов РИГА и МФА, предложенных для прижизненной и посмертной диагностики инфекционного перитонита кошек Для экспресс-диагностики болезни рекомендовано использование неспецифических, но достоверных методов йодно-агглютинационного теста и проба Ривалта

Практическая значимость. Практическая ценность работы определяется введением в лабораторную практику методов диагностики инфекционного перитонита кошек РНГА и МФА Практикующим ветврачам рекомендовано использование теста йодной агглютинации и пробы Ривалта для диагностики ИПК уже при клиническом обследовании подозрительных по заболеванию животных

Полученные результаты легли в основу нормативной документации на «Набор для выявления антител к коронавирусу плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)» Разработаны «Методические рекомендации по диагностике инфекционного перитонита кошек МФА» и «Методические рекомендации по диагностике инфекционного перитонита кошек в реакции йодной агглютинации», утвержденные в установленном порядке

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы обсуждались и одобрены на заседаниях Ученого совета, мег одических комиссиях, конференциях молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» (2002-2006гг )

Сделаны сообщения на конгрессах и конференциях II Междунар меж-вуз НПК аспир и соиск «Предпосылка и эксперимент в науке» (С-Петербург, 2004), XII Междунар Московском конгр по бол мелк дом жив (Москва, 2004), Конф молод уч, поев 75-летию ФГУ «ВГНКИ» «Лекарственные средства для животных и корма Современное состояние и перспективы» (Москва, 2006), Междунар НПК «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» поев 100-летию ЯР Коваленко (Москва, 2006), Науч Конф ФГУ «ВГНКИ» «Лекарственные средства для животных. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2007)

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.

— Результаты изучения биологических свойств вируса инфекционного перитонита кошек его патогенные, антигенные и культуральные свойства

— Применение методов РИГА, МФА, ЙАТ и пробы Ривалта для диагностики инфекционного перитонита кошек

— Результаты изучения клинических и эпизоотологических особенностей инфекционного перитонита кошек

Публикации научных исследований. Основные результаты диссертации опубликованы в 10 научных работах, в том числе изложены в заключительном отчете ФГУ «ВГНКИ» за 2000-2005 г. (№ Гос Регистрации 01 200 112122) Патентом на изобретение № 2250260 от 26 сент. 2003 г определен приоритет на «Штамм Feime Coronavirus», используемый для контроля иммуногенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики инфекционного перитонита кошек»

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на ^ листах машинописного текста и содержит разделы- введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, список литературы, практические предложения и приложения Работа иллюстрирована 22 таблицами, 8 рисунками, 24 фотографиями Список литературы включает 253 источника, в том числе 232 — зарубежных авторов

Приносим искреннюю благодарность сотрудникам ФГУ «ВГНКИ» к б н Ольшанской А А , д в н Рахманиной М М , к б н Элизбарашвили Э И , д б н , проф Обухову И JI, Яраловой Е А, Яковлевой JIА за помощь в проведении исследований, сотрудникам ГУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии» им Н Ф Гамалеи РАМН д б н Наровлянскому А Н , к б н Березиной J1К за организационную помощь в проведении экспериментов Благодарим руководителей и ветеринарных специалистов Горветлаборатории, Центральной лаборатории клиники «Мовет» и ветврачей клиник «Битус», «Центр» (Москва), «Доктора Тиханина»(С -Петербург)

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.Материалы и методы.

Работа проведена в период с 2001 г по 2007г на базе лаборатории контроля и стандартизации лекарственных средств против болезней мелких домашних животных и пушных зверей, лаборатории молекулярных методов диагностики ФГУ «ВГНКИ», виварии при ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» им Н Ф Гамалеи РАМН и ОПХ «Манихино». Материал для исследования получали из питомников и ветеринарных клиник г.г Москвы и Санкт-Петербурга, зоопарков г Москвы и г Новосибирска

Животные. Для выделения изолятов вируса использовали асцитные жидкости и селезенки 14 котят 3-12 мес возраста, подозрительных по заболеванию ИПК Для постановки биопробы — 16 беспородных котят 2-6 месячного возраста В опыте по применению различных методов диагностики ИПК на разных сроках после инфицирования использовались 12 беспородных интакт-ных котенка 2-х месячного возраста Для определения чувствительности к возбудителю болезни и изучения антигенных свойств изолятов вируса ИПК были использованы 20 кроликов породы шиншилла массой 2,5- 3 кг, 20 морских свинок массой 250-300 г и 80 белых мышей массой 14-16г Получение гипериммунных сывороток к вирусу инфекционного перитонита кошек проводили на 30 кроликах массой 2,5-3 кг

Клинический и секционный материал от 812 подозрительных по заболеванию кошек и 3-х манулов был исследован методами РИГА, МФА, ЙАТ и пробой Ривалта Результаты исследований легли в основу анализа клинико-эпизоотологических особенностей инфекционного перитонита

Штаммы микроор1 анизмов и биопрепараты. Для изготовления диагностических препаратов испочьзовали (в скобках — инфекционная активность вируса) выделенный нами штамм вируса инфекционного перитонита кошек «Багира» (5,0 ИД50/см3) Для контроля специфичности диагностических

препаратов производственные штаммьг коронавируса собак «Карат» (6,5 lg ТЦЦ 50/см3), калицивируса кошек «Jlapc» (8,0 lg ТЦД 50/см3), панлейкопении кошек «Мяу» (10,0 log2 (РГА), инфекционного ринотрахеита кошек «Гранд» (7,0 lg ТЦЦ 50/см3)

Для исключения сопутствующих заболеваний подопыгаых кошек и проверки специфичности и отсутствия контаминации полученных нами сывороток использовали зарегистрированные в РФ диагностические наборы производства НПО «Нарвак» «Набор для выявления антигена парвовирусного энтерита собак, панлейкопении кошек и вирусного энтерита норок (парво-тест)», «Набор для выявления антител к вирусу иммунодефицита кошек (вид-тест)», «Набор для выявления вируса лейкемии кошек (лейко-тест)»

Для идентификации изолятов коронавируса кошек была использована специфическая гипериммунная сыворотка, полученная от доктора J Chappius (Франция)

Культуры клеток. При поиске чувствительных тест-систем для репродукции вируса и определения его инфекционности использовали первичные и субкультуры клеток почек котенка и перевиваемые культуры клеток CrFK и FS, полученные из музея клеточных культур нашего Центра

Питательные среды и растворы. В качестве ростовых сред для первичных и субкультур клеток применяли общепринятые в вирусологии питательные среды в соотношениях, оптимальных для каждой из них

Оборудование: гомогенизатор Universal laboratory AID type MPW-309, ламинарный бокс ISO — 9002 фирмы PMV, термостаты электрические, С02 -инкубатор D-6450 фирмы Heraus, электронный микроскоп JEM-100 СХ (Япония); инвертированный микроскоп «Биолам П-1, люминесцентный микроскоп «Люмам И-1», «Олимпус СХ31», 96-луночные микропанели и многоканальные микропипетки фирмы «Costar», «Titratek», низкотемпературные и бытовые холодильники; центрифуги лабораторные низко и высокоскоростные, шуттель аппарат типа SKILO UNION

Для выделения изолятов вируса инфекционного перитонита кошек

использовали асцитнуго жидкость от 14 спонтанно заболевших котят и 12 селезенок от этих животных, которые пали или были эвтаназированы

Принадлежность изолятов к коронавирусу кошек подтверждали путем электронно-микроскопических исследований, постановкой биопробы на котятах, а также исследованиями в РИГА с использованием специфической сыворотки к инфекционному перитониту кошек (Франция)

Подготовка клинического и патматериала к исследованиям селезенки от подозрительных по заболеванию животных гомогенизировали, разводили раствором Хенкса в соотношении 1 10 и осветляли центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 минут Супернатант подвергали микрофильтрации с использованием фильтров Миллипор (0 0,45 и 0,22 мкм)

Морфологические свойства изолятов вируса ИПК изучали путем электронной микроскопии, проведенной совместно с с н с Лотте В.Д (Институт вирусных препаратов им О Г Анджапаридзе АМН РФ)

Препараты для просмотра в электронном микроскопе готовили из осадка, полученного при ультрацентрифугировании (при 40000 об /мин в течение 2 часов) микрофильтрата селезенки, ресуспендированного в фосфатном буфере (рН 7,0) В качестве контрастирующего вещества применяли 2% водный раствор фосфорновольфрамовой кислоты (рН 6,0-7,0)

Для постановки биопробы формировали 4 группы по 4 котенка 2-6 месячного возраста Двум котятам из каждой группы вводили внутрибрюшинно, и двум — орально по одному из 3-х изолятов вируса в объеме 3,0 см3. Одна группа котят служила контрольной- животным теми же способами инъецировали микрофильтрат гомогената селезенки здорового котенка За клиническим состоянием животных наблюдали 8 недель

При изучении патогенных и антигенных свойств вируса ИПК на лабораторных животных его тканевые изоляты активностью 5,0 ^ ИД 50/см3 вводили кроликам, морским свинкам и белым мышам внутрибрюшинно

или подкожно в объемах 2,0, 1,0 и 0,5см3 соответственно Еженедельно получаемые сыворотки крови исследовали в РНГА, мазки-отпечатки крови и фекалий -МФА

Изучение культуральных свойств вируса. Первично — трипсинизиро-ванные культуры клеток и перевиваемые клеточные линии готовили и поддерживали в лаборатории

Использовали стационарный метод культивирования и заражение моно-слойных культур клеток, выращенных на покровных стеклах, помещенных в пенициллиновые флаконы Посадочная концентрация первично — трипсинизи-рованных культур клеток — 250±100 тыс кл/см3, а перевиваемых — 150+50 тыс кл /см3 Результаты накопления вируса оценивали, используя МФА Для этого покровные стекла с монослоем клеток извлекали из пенициллиновых флаконов на разных сроках после инфицирования, фиксировали монослой ацетоном, окрашивали его полученной нами люминесцентной сывороткой в течение 30 мин при температуре 37°С, отмывали от красителя ФСБ рН 7,2 и просматривали в люминесцентном микроскопе Контролем служили аналогичные препараты с незараженным монослоем клеток

Гипериммунизация кроликов выполнялась по двум схемам При первой — тканевой очищенный микрофильтрацией вирус ИПК (5,0 ^ ИД 50/см3) вводили животным четырехкратно еженедельно внутримышечно в объеме 1,0см3, а затем, однократно в той же дозе внутривенно Во втором варианте вирус инъецировали в объеме 1,0 см3 с таким же количеством неполного адъюванта Фрейнда в область подколенных лимфоузлов, а через 2 месяца -без адъюванта внутривенно в объеме 0,25см3 Всех кроликов тотально обескровливали через 2 недели после заключительной инъекции антигена Полученные сыворотки исследовали на стерильность, специфичность, активность (РНГА) и отсутствие неспецифических реакций с вирусами ПЖ, ИРТ, КВК

Изготовление набора для диагностики инфекционного перитонита кошек в РНГА. Формалинизацию и танизацию эритроцитов барана проводили по стандартной методике Экспериментально подбирали оптимальные ус-

ловия для сенсибилизации эритроцитов К их суспензиям 2, 5, 10% концентрации добавляли антиген (5,0 ^ ИД 50/см3) в соотношении 1 5 Смесь инкубировали 30 минут в термостате при температурных режимах 37°С и 22°С, после чего трижды отмывали ФБР с рН 7,2 Титр антител в сыворотках крови определяли по их максимальному разведению, вызывавшему торможение ге-магглютинации

Для изготовления набора для диа! ностики инфекционно1 о перитонита кошек МФА использовали глобулин, полученный методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония из гипериммунной сыворотки кроликов, обладающей специфической активностью 1 256 (РИГА) к вирусу ИГЖ Конъюгация антител ФИТЦ проводилась в профильной лаборатории ГУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии» им Н Ф Гамалеи Полученные конъюгаты имели показатели белок -15 мг/мл, метка — 3 мг/ мл О наличии вируса в тестируемых образцах судили по обнаружению светящейся цитоплазмы клеток в исследуемых пробах при отсутствии свечения в контроле

Тест йодной агглютинации (ЙАТ). На чистое, обезжиренное спирт-эфиром предметное стекло наносили каплю сыворотки или экссудата и добавляли каплю йодного реактива Сразу после перемешивания компонентов проводили учет результатов реакции При положительном — в капле образуются темно-коричневые хлопья, а при отрицательном — капля остается прозрачной (без хлопьев и осадка) и имеет цвет йодного реактива Сомнительными считали пробы с выпадением мелкокрошковатого осадка

Тест Ривалт а. Для выполнения теста использовали 2,0% раствор уксусной кислоты, в пробирку с которой вносили каплю исследуемого экссудата Отрицательная проба характеризовалась растворением капли При положительном тесте капля экссудата сохраняет очертания и некоторое время может держаться вверху пробирки или медленно опускаться вниз в форме медузы, оставляя за собой линейный след

Статистическая обработка результатов исследований.

При анализе и обобщении результатов исследований использовали методы статистической обработки, общепринятые в биологии Вычисление среднегеометрических показателей титров антител и антигенов (х), стандартные отклонения (т) этих показателей производили с использованием компьютерной программы Excel В качестве доверительного интервала был выбран уровень вероятности Р= 0,95 (уровень значимости р-0,05)

2.2. Результаты собственных исследований

Выделение и идентификация изолятов инфекционного перитонита кошек. Из 26 образцов асцитной жидкости и гомогенатов селезенок, полученных от больных и павших кошек с подозрением на заболевание ИПК, в результате электронной микроскопии в трех были обнаружены вирусные частицы диаметром приблизительно 100 нм , морфологически сходные с коронави-русом Эти изоляты вируса были обозначены, как №№ 1, 2 и 3 и использованы в дальнейших исследованиях

Постановка биопробы с использованием трех изолятов вируса ИПК показала, что их внутрибрюшинное введение всегда вызывало развитие клинических проявлений болезни увеличение объема живота, угнетение, дегидратацию, ремитирующую лихорадку (до 40,5°С) У одного животного наблюдали симптомы поражения нервной системы ригидность конечностей, опи-стотонус, гиперестезию Наименьший инкубационный период (14-28 суток) и падеж в ранние сроки (22 — 31-е сутки) отмечен у котят, зараженных изолятом вируса №3. При пероралыюм введении изолятов вируса №1 и №2 в течение 8 недель (срок наблюдения) не выявили каких — либо клинических признаков болезни У одного котенка, зараженного тем же способом изолятом вируса №3, отмечали угнетение, истощение, лихорадку У всех павших или эвтанази-рованных по окончании опыта котят, обнаружены типичные для ИПК патана-томические изменения органов разной степени выраженности Котята кон-

трольной группы остались клинически здоровыми, после их эвтаназии патологических изменений внутренних органов не выявлено

Приготовление эрнтроцитарного диагностикума. Изолят вируса № 3 был использован нами для конъюгации эритроцитов, проведенной с суспензиями эритроцитов 2-10% концентраций, при разных температурных режимах и экспозициях Установлено, что оптимальные условия конъюгирования эритроцитов антигеном вируса ИПК следующие смешивание 5%-ной суспензии танизированных эритроцитов с микрофильтратом тканевого вируса ИПК в соотношении 1 5, инкубировние смеси в течение 30 минут в термостате при температуре 37°С

Контроль приготовленного диагностикума проводили на отсутствие самоагглютинации Его специфичность подтверждали с полученной из Франции стандартной сывороткой, титр с которой в РНГА составил 1 512 РНГА с сыворотками, содержащими антитела к вирусам ПЛК, КВК и ИРТ показали отрицательный результат

Для изучения паюгенности и антигенности изолятов вируса ИПК для лабораторных животных их вводили интактным кроликам, морским свинкам и белым мышам внутрибрюшинно или подкожно Тем же видам животных контрольной группы инъецировали микрофильтрат гомогената селезенки здорового котенка

Результаты опыта показали, что однократное введение вируса ИПК не вызывало каких-либо клинических признаков болезни у этих животных При исследовании мазков крови и фекалий МФА вирусовыделения у них не обнаружено Как подкожное, так и внутрибрюшипное введение изолятов вируса вызвало накопление антител, которое было максимальным на 21 сутки и составило, в частности, при инъекции изолята № 3 у кроликов — 6,9 log2 (РНГА), у морских свинок — 6,6 log2 и белых мышей — 6,3 log2

Таким образом, установлено, что изолят №3 вируса инфекционного перитонита кошек обладал наибольшей патогенностью для котят и антигенно-стью для лабораторных животных Этот изолят был типирован в лаборатории

молекулярных методов диагностики ФГУ «ВГНКИ» как вирус инфекционного перитонита кошек

При изучении условий хранения, обеспечивающих стабильность инфек-ционности вируса установлено, что при температуре минус 70°С, снижение его титра за каждый год хранения составляло в лиофилизированных образцах приблизительно 1,0 ^ ИД 5 О/см , в замороженных -1,0-1,5 ^ ИД 50/см3. При температурном режиме минус 19°С инфекционная активность вируса снижалась на 1,5-2 ,0 ИД 50/см3 ежегодно

Проведенные исследования дали основание для паспортизации и депонирования в коллекцию микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» штамма вируса ИПК (изолят №3), получившим название «Багира»

Для получения гипсриммунпых сывороток использовали тканевой, очищенный микрофильтрацией штамм вируса ИПК Багира активностью 5,0 % ИД 50/см3 , который вводили двум группам по 15 интактных кроликов по двум выше описанным схемам

Более высокую — 7,0 -10,0 активность в РНГА показали сыворотки крови, полученные от кроликов, иммунизированных способом с использованием эффекта «иммунной памяти» Полученные сыворотки прошли контроль стерильности и отсутствия неспецифической активности с антигенами вирусов ПЛК, ИРТ и КВК и были использованы при постановке РНГА как позитивные контрольные, а так же для изготовления диапюстикума МФА Установлено чго, хранение специфических сывороток в лиофилизированном состоянии при температуре от 4°С до -19°С и в замороженном при -19°С в течение 2 лет снижает их титр не более, чем на 2,0 1о§2 (РНГА)

Диагностика инфекционного перитонита кошек в РНГА. При исследовании в РНГА проб сывороток крови и асцитных жидкостей от 812 кошек в 319 образцах клинического материала титр составил 1 256 и выше (табл 1)

Результаты диагностики инфекционного перитонита кошек в РНГА

Количество Титр в РНГА Диагноз на ИПК

животных При первом исследовании При повторном исследовании Первичный Окончательный

319 1 256-1 4096 н/и Положительный

118 1 32-1 128 1 4 — 1 32 Сомнительный Отрицательный

22 1-32-1 128 1 256 — 1 1024 Сомнительный Положительный

353 Рахманина, Надежда Алексеевна :: 2007 :: Москва

1.1. Актуальность темы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Научная новизна

1.4. Практическая значимость

1.5. Апробация работы

1.6. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту

1.7. Публикации научных исследований

1.8. Структура и объем диссертации

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. СВЕДЕНИЯ О ВОЗБУДИТЕЛЕ БОЛЕЗНИ

1.1.1. Историческая справка. Этиология болезни

1.1.2. Таксономическое положение вируса ИПК

1.1.3. Антигенные разновидности и родство вируса ИПК с другими представителями этого рода

1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЕЗНИ

1.2.1. Эпизоотологические данные

1.3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИПК

1.3.1. Выделение изолятов вируса и экспериментальное заражение.

1.3.2. Морфология вируса ИПК

1.3.3. Культуральные свойства вируса ИПК

1.3.4. Чувствительность вируса к физико-химическим факторам.

1.4. ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННОГО ПЕРИТОНИТА

1.4.1. Клинические признаки болезни

1.4.2. Паталогоанатомические изменения

1.4.3. Биохимические методы диагностики ИПК

1.4.4. Серологические методы диагностики

1.4.5. Сопоставление методов диагностики коронавирусной инфекции кошек

1.5. СРЕДСТВА ПРОФИЛАКТИКИ КОРОНАВИРУСНОЙ

1.5.1. Специфическая профилактика ИПК.

1.5.2. Профилактические мероприятия

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО ПЕРИТОНИТА КОШЕК

2.2.1.1.Выделение и идентификация изолятов вируса инфекционного перитонита кошек

2.2.1.2.Изучение чувствительности лабораторных животных к вирусу ИПК при экспериментальном заражении

2.2.1.3.Изучение культуральных свойств вируса инфекционного перитонита кошек

2.2.1 АИзучение стабильности вируса инфекционного перитонита кошек к хранению в разных условиях

2.2.1.5.Паспортизация и депонирование штамма «Багира» инфекционного перитонита кошек.

2.2.2. ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННОГО ПЕРИТОНИТА КОШЕК

2.2.2.1 .Получение гипериммунных сывороток на кроликах.

2.2.2.2.Изготовление конъюгированных антигеном ИПК эритроцитов. Диагностика инфекционного перитонита кошек в РИГА

2.2.2.3. МФА при диагностике инфекционного перитонита кошек.

2.2.2.4. Биохимические и гематологические исследования.

2.2.2.5.Экспресс-диагностика ИПК в реакции йодной агглютинации

2.2.2.6. Экспресс-диагностика ИПК с использованием теста Ривалта

2.2.2.7. Диагностика инфекционного перитонита кошек на разных сроках после экспериментального заражения

2.2.2.8. Сравнительная оценка методов диагностики инфекционного перитонита кошек

2.2.2.9. Клиническая и патологоанатомическая диагностика.

Эпизоотологический анализ полученных результатов

Источник